徕卡显微镜：萤光蛋白及荧光计时器

术语“萤光蛋白”结合了一组基因改变的荧光蛋白，具有非常特殊的属性：它们可以从一个非荧光状态激活，他们可以改变他们的发射光谱或进行切换和关闭，他们甚至能够“为很多次。此行为是由于一些独特的照片的物理属性。在单分子水平，许多荧光蛋白显示闪烁的活动可以由外部照明的影响的特性。有明显分别发射和非发射新的发射状态，所表达的内容属性光可活化，photoconvertible的的或光开关，光学荧光笔蛋白突变的荧光蛋白。另一个有趣的类型的荧光蛋白荧光定时器能够改变它们的颜色随着时间的推移。下面的文章将给予这些“特殊”的荧光蛋白的选择的概述。

光活化的蛋白

光活化的蛋白可以“接通”从低荧光状态到一个更高的荧光状态。此开关期间发生的事件的第二小于施加短暂的光脉冲在紫色/蓝色光谱，并允许动态细胞过程的检测。感兴趣的区域（ROI）中的分子定向光活化可用于监测这些被激活的细胞内的蛋白质的运动。而像FRAP在其他脉冲追逐的实验设置一个不能区分蛋白质重新进入的投资回报率和新合成的分子，光敏绕过这个问题的方法之一。

第一光活化的蛋白是一个wtGFP变体，并，，由Lippincott-Schwarz和帕特森已经建立。它包括的单点突变（T203H），这会导致一个非常低的区域从450到550nm的吸光度。被光活化与紫色光的帮助下，PA-GFP（绿色荧光蛋白光活化的）开关从400到504 nm的最大吸收。因此，其荧光增加CA。100倍，当用波长为488 nm，什么样的是反映在激活的和未激活的蛋白之间形成了鲜明对比激发[ 1 ]。

PA-GFP的激活过程中的基本过程似乎是谷氨酸的侧链残基222的光致脱羧。这种损失的二氧化碳改变了发色基团的配置从一个中性的阴离子状态[ 2 ]。

这里应该提到另一个候选是Phamret（光活化介导的共振能量转移），这是一个特殊的串联二聚体的荧光蛋白，光活化的荧光共振能量转移。phamret的融合蛋白组成的一个PA-绿色荧光蛋白的共价耦合到FRET伙伴ECFP。在480 nm到458 nm波长的曝光导致排放ECFP。相邻光敏PA-GFP有405nm的激光束。在这之后，反复暴露于458纳米导致FRET激发ECFP和PA-GFP之间的，在绿色荧光。因此，“无效”和“活跃”的形式，可以激发出相同的激光波长。可能是负的特性的蛋白质的大小，这是由两个荧光蛋白，可能唤起空间位阻问题。

值得注意的是，光活化的蛋白通常显示降低亮度相比，EGFP的耐光性降低，并显示出。

图 1：光激活FPS可以切换“开”蓝色/紫色光谱光照射在荧光状态从非荧光状态。Photoconvertable的FPS是能够改变他们的荧光发射光谱，从一个到另一个最大。这也被触发，通过曝光与目标波长的光。可以切换光开关的FP“开和关”的两个不同波长的光脉冲的帮助。该循环可以执行至几百倍。改变其发射光谱荧光计时器时间。在他们的帮助下，它是可能的关联的蛋白质，例如年龄和蜂窝位置

Photoconvertible蛋白质

在光活化的蛋白相比，photoconvertible发出荧光的蛋白质已经在他们的非转换的状态。因此，它是更容易定义您的投资回报率。光电转换被发现在石开脑珊瑚Trachyphyllia geoffroyi中。由于其排放的属性，正在从绿色变为红色光转化后用紫外光，荧光蛋白被命名为枫像日本槭树的叶子[ 4 ]。秋天，他们把颜色从绿色变为红色。如果枫380和400纳米之间的波长，其最大发射光转换正在发生变化，从518纳米到582纳米。这显示在绿色和红色荧光的因素2,000之间的比例大幅改变。这种转换是不可逆的。另一个限制因素是枫四聚体的性质，是什么使活细胞成像研究它，而没有吸引力。

光转化的基本过程又是一个光诱导过程。在这种情况下，内部的发色团（His61-Tyr63-Gly64）组氨酸残基被裂解的照射，并最终导致一个形成一个高度共轭的双咪唑环系统。这个过程被连接到红色波长[ 2 ] 荧光移位。

一个红色绿色兑换FP来自珊瑚Dendronephtytha SP。它的名字和红色的激活属性都反映表达将Dendra [ 5 ]。商业发展Dendra2是第一单体红-绿色photoconvertible的蛋白质。

另一种广泛使用的光学荧光笔tdEosFP [ 6 ]，主要是从Labophyllia hemprichii，石珊瑚隔离。串联二聚体可以转换从绿色到红色荧光的近紫外线照射后，欣然用于超分辨率显微镜，什么是真正的单体版本MEOS mEos2个。

非常相似的特征Keadeàphotoconvertible的蛋白质被发现在第三个石珊瑚：法维亚瘌痢。近紫外线照射四聚体KikGR的后改变其荧光从绿色变为红色，但在一个更美好的方式比枫。其商业的变体被称为Kikume，可以用750 nm波长的多光子激发的光转换。类似这样的，它可以被用来在厚的组织标本。突变导致KikGR单体形式mKikGR的。连同与mEos2 Dendra2它是一个经常使用的光学超分辨成像荧光笔。

光开关染料

而光敏化是一个不可逆转的转换，从一个非荧光状态的荧光状态，光开关蛋白能两个条件之间的班车。不同波长的光脉冲，这些荧光蛋白的帮助，可以打开和关闭的几百倍不漂白。荧光灯和暗态之间进行切换，这样的现象，被称为光致变色的，已经显示了在单分子水平wtGFP，但一个非常低的延伸。

一个众所周知的光开关的蛋白质，它是用来在超高分辨率显微镜，是来自于一个石珊瑚：Dronpa是单体，并在390 nm处的最大吸收波长为503纳米，由于它的阴离子，去质子化的发色团，有小absoption最大由于它的中性，质子化的发色团。而阴离子形式在518 nm处具有最大发射，中性的形式描绘了一个非荧光状态。此外，还有一个顺式-反式异构化，质子化的发色团连接。的发色基团的中性态Tyr66的侧链中的反式构型（第2图）。在其阴离子国家Tyr66具有顺式构象。有405nm照射后，被强制进入激光脉冲Dronpa的荧光顺式构象。488 nm激光脉冲然后切换Dronpa的构象非荧光反状态。该循环可以重复几百次。

图2：使用超高分辨率显微镜的光开关蛋白Dronpa的

四聚体蛋白在红色区域的最大发射光开关Kindling FP（KFP1）。

最新努力创造新的光学荧光笔想出了这是一种蛋白质，光电转换和光控相结合。IrisFP是一个wtEosFP的一个开和关的开关状态，以及其绿色荧光红色荧光构衍生。换句话说，照射高强度的405nm的激光束IrisFP后转移从绿色到红色的发光状态。格林IrisFP的可以被关掉的帮助下为488 nm的激光。在405纳米的低强度激光开关再次打开。红IrisFP另一方面关闭用532 nm的激光的光，并且可以具有440 nm的激光再次接通。相邻的建设单体形式mIrisFP的打开门为进一步的应用[ 3 ]。

荧光计时器

正在改变他们的发射光谱的时间被称为荧光蛋白的荧光计时器。此行为是不pH值的变化，离子强度或蛋白质浓度的结果，但独立于这些生化指标发生。换句话说有关的蛋白的年龄可以估算它的颜色。具有这些特征的，有可能测量在活细胞内的时间-时间取决于发生的事情- 。

在2000年，由实验室的谢尔盖·A.卢科亚诺夫第一荧光定时器描述。这种红色荧光蛋白突变体命名为FT（荧光定时器）改变其发射光谱在18小时期间从红色到绿色波长。由于这样的事实，FT的四聚体Vladislav Verkhusha的看到有必要创造一个单体的。突变的mCherry导致3荧光定时器，具有不同的转换时间。这些蛋白质被转向快速，中速或慢速的时间尺度从蓝色到红色，但仍然太慢测量细胞在几分钟内发生的进程（S. 表1）。

然而，随着荧光计时器的帮助下，它未能观看蛋白在活细胞中，无论是在空间和时间分辨率的行为。例如，分化和细胞极化过程可以观察到。此外，蛋白质运输的事件或病毒装配可以跟踪或基因的活性可以被监控。该应用程序列表中一定能进行扩展和显示荧光定时器在未来的潜在用途

表1：萤光蛋白和荧光计时器

Exmax：最大激发，Emmax：最大发射，QY：量子产率，亮度计算量子产率和摩尔消光系数的乘积除以1,000